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   Responsabile:  Barbara Ensoli
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Attività di ricerca

Attività di ricerca del reparto "Interazione virus-ospite (Core Lab di Immunologia)"

Direttore: Dr. Paolo Monini

Risposte umorali nell’infezione da HIV e in risposta a vaccinazione con immunogeni di HIV/SIV
Le risposte umorali contro gli antigeni virali strutturali sono molto frequenti in tutti i soggetti HIV+. Al contrario, la prevalenza di anticorpi anti-Tat è piuttosto bassa nei soggetti HIV+, ma significativamente più elevata nei “long-term non-progressor”, suggerendo un ruolo protettivo di questi anticorpi (Rezza G. et al., J. Infect. Dis. 2005). Molti soggetti infettati, inoltre, hanno anticorpi anti-HIV neutralizzanti i quali, tuttavia, non sono in grado di controllare l’infezione né di bloccare la progressione. Lo studio delle risposte umorali indotte da vaccinazione e/o nel corso dell’infezione in modelli animali e nell’uomo è quindi prioritario per la comprensione della patogenesi virale, per la caratterizzazione delle risposte ai vaccini in fase di sviluppo e sperimentazione, e per l’allestimento di future strategie vaccinali e immunoterapeutiche. In questo contesto, gli obiettivi del CNAIDS sono i seguenti:
- Valutazione delle risposte umorali nell’infezione naturale da HIV e in scimmie vaccinate o non vaccinate, in seguito a esposizione al virus;
- Valutazione della presenza di risposte anticorpali indotte da vaccinazione nei modelli animali prescelti (topi, conigli, scimmie) e nell’uomo;
- Caratterizzazione degli anticorpi presenti nel siero/plasma mediante determinazione di: i) titolo degli anticorpi di legame (inclusa la differenziazione in classi e sottoclassi immunoglobuliniche); ii) titolo degli anticorpi neutralizzanti; iii) spettro d’azione delle risposte anticorpali (riconoscimento di antigeni virali/virus appartenenti a ceppi e/o sottotipi virali diversi da quello vaccinale); iv) specificità anticorpale; v) altre attività anti-virali (citotossicità cellulare anticorpo-dipendente);
- Confronto tra vaccini di composizione e formulazione diverse per l’identificazione dei candidati vaccinali più promettenti da sviluppare e valutare in futuri trial clinici;
- Studio degli effetti di Tat sul fenotipo, differenziamento, sopravvivenza, priming, funzione delle cellule B in risposta ad altri antigeni di HIV/SIV, e sul mantenimento e espansione della cellule B memoria;
- Analisi della formazione dei centri germinativi nei linfonodi regionali di animali vaccinati con Tat;
- Studio della localizzazione di Tat nei centri germinativi (endoteli, cellule dendritiche follicolari) in animali infettati, vaccinati o naive;
- Determinazione degli effetti di Tat extracellulare sulla capacità di neutralizzazione del virus di plasmi e sieri di primati infettati/vaccinati e di soggetti infettati/vaccinati.

Studio degli effetti della proteina Tat sulle cellule dendritiche e sulle attività immunomodulatorie delle cellule dendritiche: attivazione linfocitaria e suscettibilità dei linfociti all’infezione da HIV-1
La proteina Tat di HIV, prodotta soprattutto nelle fasi iniziali dell’infezione, viene rilasciata nell’ambiente extracellulare dove esercita azioni chiave sulle cellule circostanti. In particolare, Tat è in grado di aumentare l’espressione dei co-recettori CXCR4 e CCR5 nei linfociti e monociti del sangue periferico, aumentandone la suscettibilità all’infezione da parte di ceppi di HIV-1 X4- e R5-tropici. Il nostro gruppo ha dimostrato che Tat entra selettivamente in cellule dendritiche di origine monocitaria (MDDC) a concentrazioni nano/picomolari, ed è in grado di indurne la maturazione, di aumentarne la capacità di presentazione dell’antigene, di stimolare la produzione da parte di queste cellule di citochine e chemochine associate a un’attività polarizzante di tipo Th1 (Fanales-Belasio E. et al., J. Immunol. 2002 e 2009). MDDC trattate con Tat si sono dimostrate superiori a MDDC non trattate nell’indurre risposte allogeneiche e di richiamo in vitro. Importanti conferme a queste evidenze sono venute da studi condotti in modelli animali (topi e scimmie). In questi studi, Tat è stato associato alla vaccinazione con altri antigeni virali (Env, Gag) e la risposta immune indotta confrontata a quella ottenuta vaccinando senza Tat o con un Tat mutato privo della capacità transattivante (Tatcys22). I dati ottenuti in questi modelli hanno dimostrato che solo il Tat nativo è in grado di incrementare e modulare in senso Th1 la risposta immunitaria contro altri antigeni virali (Gavioli R. et al., J. Immunol. 2004; Gavioli R. et al., Vaccine 2008). Inoltre, nel modello murino Tat ha indotto il mantenimento o l’espansione nel tempo di cellule effettrici specifiche citotossiche per altri antigeni virali, suggerendo ulteriori attività immunomodulatorie (Gavioli R. et al., Vaccine 2008; Caputo A. et al., Vaccine 2008). È ipotizzabile, perciò, che Tat promuova l’attivazione delle cellule del sistema immunitario, favorendo in tal modo anche l’efficienza della replicazione virale.
In questo contesto, sono state avviate le seguenti attività:
- Valutazione della capacità da parte di MDDC, trattate con Tat nativa e biologicamente attiva o con Tatcys22 privo della capacità di transattivazione, di modificare lo stato di attivazione e la proliferazione di linfociti autologhi;
- Valutazione della modulazione dell’espressione di marcatori di attivazione (HLA-DR, CD69, CD25), citochine Th1 e Th2 e beta-chemochine;
- Valutazione del profilo trascrizionale linfocitario usando sistemi di analisi basati su microarray;
- Valutazione della suscettibilità dei linfociti coltivati insieme a MDDC trattate con Tat all’infezione da parte di ceppi HIV-1 R5- o X4-tropici.

Studio dell’immunità naturale e adattativa cellulare in risposta ad antigeni di HIV/SIV
Abbiamo recentemente dimostrato che la proteina Tat biologicamente attiva promuove la maturazione e l’attivazione delle MDDC e ne potenzia l’attività di presentazione dell’antigene, come dimostrato in vitro con saggi di valutazione della risposta allogeneica o ad antigeni di richiamo (Fanales-Belasio E. et al., J. Immunol. 2002 e 2009). È stato inoltre riportato che anche la proteina Nef di HIV-1 ha effetti immunomodulatori/disregolatori. E’ plausibile che questi effetti siano importanti sia per la comprensione della patogenesi virale che per un loro utilizzo in vaccinologia. Per quanto concerne le implicazioni patogenetiche è noto che Tat e Nef sono espresse molto precocemente nel corso dell’infezione e, pertanto, potrebbero modificare la risposta immunitaria dell’ospite rendendola inefficace contro il virus. Dall’altra parte, la dimostrazione che un antigene virale possiede molteplici attività immunoregolatorie ne fa intravedere un possibile futuro utilizzo come immunomodulatori e adiuvanti vaccinali. Poiché il Centro Nazionale AIDS è fortemente impegnato in studi sia di patogenesi che di vaccinologia, è di grande importanza la messa a punto e l’utilizzo di metodologie volte a caratterizzare in dettaglio i vari aspetti della risposta immune a queste proteine regolatorie di HIV-1, e all’HIV in generale, in vitro ed ex vivo, in vari modelli animali. In particolare si tratterà di valutare l’attività di adiuvanza di Tat su vari tipi cellulari, sia in vitro che ex vivo mediante l’impiego di metodologie per l’analisi del trascrittoma (microarray) e del proteoma per meglio definire le modalità e gli effetti di questa adiuvanza a livello di immunità naturale (citochine infiammatorie e soppressorie, chemochine, fattori anti- e pro-apoptotici, IFNs e proteine del ciclo cellulare, ecc.) e adattativa. Un approccio simile verrà utilizzato per la caratterizzazione della risposta dell’ospite, vaccinato o naive, all’infezione virale. Lo scopo è l’identificazione di pattern distinti d’espressione di geni dell’immunità innata e adattativa in animali che controllano l’infezione virale, spontaneamente o dopo vaccinazione, al fine di poterli indurre in corso di vaccinazione e dopo infezione sperimentale (challenge).

Sviluppo di sistemi innovativi di veicolazione di principi attivi a scopo terapeutico e vaccinale
Il CNAIDS si propone di sviluppare nuovi vaccini contro l’HIV/AIDS caratterizzati da elevata sicurezza ed efficacia e in grado di indurre risposte immunitarie durevoli sia a livello mucosale che sistemico. A questo scopo, il Centro è impegnato nello sviluppo di una nuova piattaforma tecnologica basata sull’uso di micro- e nano-particelle biocompatibili, involucri (ghosts) batterici e virosomi per la veicolazione di antigeni proteici o acidi nucleici (Caputo A. et al., Vaccine 2004; Caputo A. et al., Current Drug Deliv. 2008).

Veicolazione e modulazione della presentazione di antigeni da parte di Tat in cellule endoteliali vascolari e linfatiche per l’induzione di un’immunità protettiva contro HIV
Le cellule endoteliali del sistema vascolare e linfatico stabiliscono importanti rapporti funzionali con il sistema immune. Per esempio, producono citochine che richiamano cellule immunitarie e stimolano la presentazione dell’antigene da parte dei monociti che trasmigrano ai siti di infiammazione, promuovendone, al tempo stesso, il differenziamento in cellule dendritiche (DC) o in macrofagi. Le cellule endoteliali stesse agiscono quali cellule presentanti l’antigene (APC), poiché internalizzano, processano e presentano antigeni ai linfociti T, e stimolano i linfociti T adesi all’endotelio. In virtù di queste proprietà, le cellule endoteliali giocano un ruolo cruciale nell’induzione delle risposte immuni locali, poiché reclutano APC ai siti d’infiammazione e, presentando antigeni alle cellule T circolanti, richiamano linfociti antigene-specifici ai siti di infezione. Il Centro intende sfruttare queste caratteristiche delle cellule endoteliali a scopi vaccinali. In questo contesto, gli studi compiuti nel Centro hanno indicato che la proteina Tat, rilasciata di linfociti T infettati, è selettivamente internalizzata sia da cellule dendritiche che endoteliali attivate, grazie a specifici recettori integrinici di superficie (Fanales-Belasio E. et al., J. Immunol. 2002 e 2009; Ensoli B., dati non pubblicati). Inoltre, Tat induce in entrambi i tipi cellulari l’espressione di citochine e chemochine, recettori per l’homing dei leucociti, e molecole di superficie che stimolano i linfociti a rispondere al contatto con gli antigeni processati e presentati da queste cellule (molecole co-stimolatorie) (Fanales-Belasio E. et al., J. Immunol. 2002 e 2009; Ensoli B., dati non pubblicati). Pertanto, Tat potrebbe essere utilizzata come vettore per indirizzare antigeni di HIV agli endoteli e/o come adiuvante per indurre o accrescere la capacità di presentazione antigenica delle cellule endoteliali vascolari e linfatiche.

Vie di trasduzione del segnale indotte da Tat nella regolazione del ciclo cellulare e della motilità cellulare
Il sarcoma di Kaposi (KS) insorge e progredisce in soggetti con sistema immunitario disregolato (per una review, Barillari G. et al., Research Signpost 2009). In questi soggetti l’aumentata produzione di mediatori dell’infiammazione attiva gli endoteli e induce la produzione di fattori angiogenici, inclusi il fattore di crescita dei fibroblasti basico (bFGF) che è espresso ad elevati livelli nelle lesioni di KS (Barillari G. et al., Research Signpost 2009). A questo riguardo, nostri studi recenti hanno indicato che mediatori dell’infiammazione o il bFGF aumentano fortemente nelle cellule KS l’attività telomerasica, una ribonucleoproteina che preserva la lunghezza delle estremità dei cromosomi, consentendo alle cellule di replicare indefinitivamente (Barillari G. et al., Int. J. Cancer 2010). Inoltre, l’aumento dell’attività telomerasica promossa da molecole infiammatorie o angiogeniche procede in parallelo con l’induzione di dell’invasività delle cellule KS (Barillari G. et al., Oncol. Rep. 2010). In accordo con questoi risultati, abbiamo osservato che il bFGF riduce in cellule vascolari primarie umane l’attività di p53, una importante proteina soppressoria della crescita e dell’invasività cellulare (Barillari G et al., Atherosclerosis 2010).
Nostri studi precedenti hanno indicato che la proteina Tat di HIV, rilasciata dalle cellule T acutamente infettate, agisce da fattore di progressione del KS associato ad AIDS grazie alla sua capacità di legarsi a recettori integrinici e di aumentare gli effetti del bFGF (Ensoli et al., Nature 1994). In particolare il Tat ed il bFGF cooperano nell’indurre la proliferazione e motilità delle cellule endoteliali attivate e delle cellule KS, svolgendo pertanto un ruolo chiave nei fenomeni angiogenici che accompagnano la progressione della malattia (reviewed in Barillari G. and Ensoli B., Clin. Microb. Rev. 2002). A tale proposito abbiamo scoperto che il legame di Tat alle integrine espresse sulla superficie di cellule endoteliali attivate e cellule KS incrementa ulteriormente l’attività telomerasica (Barillari G. et al., Oncol. Rep. 2010) e promuove l’attivazione di vie di trasduzione del segnale, che a loro volta aumentano la capacità del bFGF di promuovere la proliferazione e la motilità in cellule endoteliali (Toschi E. et al., Mol. Biol. Cell 2001 and 2006). Questi studi contribuiranno non solo a definire i meccanismi con cui Tat agisce da fattore di progressione nell’AIDS-KS, ma porteranno all’identificazione di nuovi bersagli per il blocco dell’attivazione, della crescita, della sopravvivenza e della motilità delle cellule endoteliali e KS. L’identificazione di questi bersagli aprirà nuove prospettive per lo sviluppo di terapie anti-angiogeniche e anti-tumorali non solo per il KS ma anche per altri tipi di tumori, nei soggetti infettati e non infettati da HIV.

Attività anti-tumorale degli inibitori delle proteasi di HIV in associazione o meno a chemioterapia: studi preclinici
Le recenti terapie antiretrovirali combinate (HAART) hanno indotto una significativa riduzione dell’incidenza dei tumori AIDS-associati, quali il KS e i linfomi non-Hodgkin. Il trattamento con HAART, inoltre, è spesso associato alla regressione di queste neoplasie. Ciò riflette la capacità di tali terapie di bloccare la replicazione di HIV, promuovere la ricostituzione del sistema immunitario, e di ripristinare risposte efficaci immuni contro i virus oncogeni associati a queste neoplasie (Monini P. et al., Nat. Rev. Cancer 2004). Studi recenti hanno indicato, tuttavia, che la terapia HAART esercita sui tumori effetti addizionali indipendenti dalle sue azioni su HIV e sul sistema immunitario (Monini P. et al., Nat. Rev. Cancer 2004). In particolare queste ricerche indicano che gli inibitori della proteasi di HIV (HIV-PI), una classe di anti-retrovirali frequentemente inclusa nei regimi HAART, esercitano potenti azioni anti-angiogeniche e anti-tumorali poiché sono in grado di bloccare l’invasione delle cellule endoteliali e neoplastiche (Sgadari C. et al., Nat. Med. 2002; Barillari G. et al., Drug Res. Upd. 2003; Sgadari C. et al., Lancet Oncol. 2003; Monini P. et al., J. Antimicr. Chemother. 2003; Monini P. et al., Nat. Rev. Canc 2004; Monini P. et al., Cancer Treat. Rev. 2006; Toschi E. et al., Int. J. Cancer 2010). Il Centro ha perciò avviato studi in modelli preclinici in vitro ed in vivo volti a determinare l’azione anti-angiogenica e anti-tumorale degli HIV-PI in associazione o meno a farmaci citotossici convenzionali, ad identificare nuovi bersagli per la terapia anti-angiogenica e anti-neoplastica, ed a sviluppare e validare nuovi analoghi e derivati degli HIV-PI dotati di maggiore efficacia e minore tossicità.

Azione Concertata per lo “Studio di fase II per la terapia di pazienti affetti da sarcoma di Kaposi classico con gli inibitori della proteasi di HIV”
Il KS è un tumore angioproliferativo che insorge in soggetti anziani dell’area mediterranea (KS classico), in trapiantati d’organo e, con accresciuta frequenza ed aggressività, in pazienti con infezione da HIV (AIDS-KS) (Barillari G. et al., Research Signpost 2009). Il KS è caratterizzato da intensa angiogenesi e origina in un contesto di immunodisregolazione caratterizzato da aumentata produzione di citochine infiammatorie, fattori angiogenici ed enzimi in grado di degradare la matrice extracellulare (metalloproteasi, MMP) (Barillari G. et al., Research Signpost 2009). Le terapie convenzionali per il CKS sono caratterizzate da elevata tossicità, hanno carattere palliativo, effetti temporanei, e non vi è trattamento d’elezione (Toschi E. et al., Anticancer Drugs 2002). Vi è perciò una grande urgenza di terapie innovative per il trattamento di questa malattia. Recentemente è stata descritta una ridotta incidenza o regressione del KS nei soggetti HIV+ trattati con terapie antiretrovirali di combinazione (HAART) contenenti almeno un HIV-PI. Studi di base e preclinici precedentemente condotti dal Centro hanno indicato che questi farmaci sono in grado di inibire l’angiogenesi e l’invasione tumorale mediante il blocco dell’attivazione proteolitica di MMP-2, una metalloproteasi che svolge un ruolo essenziale nell’angiogenesi e nell’invasione tumorale (Sgadari C. et al., Nat. Med. 2002; Monini P. et al., Nat. Rev. Cancer 2004; Toschi E. et al., Int. J. Cancer 2010). Questi risultati son o stati ottenuti in modelli preclinici in assenza di infezione da HIV o dell’azione di cellule immunitarie, suggerendo che gli HIV-PI abbiano effetti anti-tumorali diretti.
Per valutare le azioni antitumorali di questi farmaci, il nostro Centro ha promosso una sperimentazione clinica multicentrica di fase II per il trattamento di pazienti affetti da KS classico con indinavir, uno farmaco appartenente alla classe degli HIV-PI. La sperimentazione è avvenuta nel quadro dell’Azione Concertata sul Sarcoma di Kaposi (Programma Nazionale AIDS), in collaborazione con Merck Italia. I risultati di tale studio indicano che il trattamento con indinavir è ben tollerato nei pazienti con KS classico e che promuove regressione di malattia in pazienti in stadio iniziale e stabilizzazione negli stadi più avanzati (Monini P. et al., AIDS 2009). È da sottolineare, inoltre, che che la risposta clinica è associata ad alti livelli plasmatici di indinavir, e a riduzione di marcatori di angiogenesi e invasione tumorale.

Studio clinico di fase II per il trattamento del sarcoma di Kaposi classico avanzato con l’inibitore della proteasi di HIV indinavir in associazione a chemioterapia con Vinblastina e Bleomicina
I risultati ottenuti recentemente con lo studio clinico di fase II indicano che l’HIV-PI indinavir potrebbe rappresentare uno strumento efficace nel trattamento delle fasi iniziali del KS classico (non associato ad HIV) (Monini P. et al., AIDS 2009), e che nel KS avanzato potrebbe essere utilizzato in associazione a chemioterapia convenzionale. Il Centro ha quindi avviato una sperimentazione clinica in collaborazione con l’Ospedale Maggiore di Milano volta a valutare la risposta clinica all’indinavir in combinazione a chemioterapia in pazienti affetti da CKS in stadio avanzato.

Uso degli inibitori della proteasi dell’HIV per fermare la progressione e le recidive del cancro della cervice uterina nelle persone HIV negative
Dati clinico-epidemiologici indicano che la terapia HAART è associata a riduzione dell’incidenza o regressione delle neoplasie intraepiteliali della cervice uterina (CIN) indipendentemente dai suoi effetti sull’infezione virale e sulla ricostituzione immunologica (Monini P: et al., Nat. Rev. Cancer 2004), suggerendo un effetto anti-tumorale diretto della HAART sul CIN, come già osservato per il KS. Nonostante l’introduzione dei test di prevenzione di massa, la progressione delle lesioni displastiche della cervice uterina in carcinoma invasivo rappresenta ancora un’importante causa di malattia e morte fra le donne. Sulla base di queste osservazioni e deglie effetti anti-tumorali degli HIV-PI evidenziati dai nostri studi preclinici e clinici, abbiamo avviato studi in vitro ed in vivo per valutare l’effetto degli HIV-PI in modelli di CIN e carcinoma cervicale.
In particolare, stiamo valutando gli effetti degli HIV-PI in vitro su linee cellulari di CIN infettate da papillovavirus umano (HPV) oncogenico e in vivo in un modello sperimentale di CIN che insorge in topi transgenici (topi K14-HPV16/E2) (Giraudo et al., J. Clin. Invest. 2004). Inoltre, abbiamo avviato degli studi clinici preparatori necessari alla progettazione e la conduzione della sperimentazione clinica. A tale scopo, stiamo determinando l’incidenza, il rischio di progressione/recidiva e la regressione spontanea del CIN nei territori dei siti clinici coinvolti nello studio (Lombardia ed Emilia Romagna). Infine, verrà eseguito uno studio clinico di tipo “proof of concept” su pazienti sieronegative affette da CIN volto a determinare l’efficacia degli HPV-PI sulla prevenzione, progressione e recidiva del CIN.

Pubblicato il 03-11-2010 in Attività di ricerca , aggiornato al 28-03-2014

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