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   Responsabile:  Barbara Ensoli
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Attività di ricerca

Attività di ricerca del reparto "Retrovirologia sperimentale e modelli di primati non umani (Core Lab di Virologia)"

Direttore: Dr. Fausto Titti

Trasmissione mucosale dell’infezione di HIV.
Le superfici mucosali costituiscono la più ampia superficie del corpo umano e rappresentano la prima linea di difesa contro molti patogeni. Oltre il 90% degli agenti infettivi nell'uomo accedono attraverso le membrane mucosali, sia per trasmissione orizzontale (rapporto sessuale) o verticale (parto e allattamento). Virus come poliovirus, virus erpetici infettano direttamente le cellule epiteliali e quindi sono più facilmente trasmessi rispetto all’HIV. Infatti, le cellule della mucosa presenti al sito d'ingresso, non sono considerati tra i bersagli preferenziali del virus HIV. Il tessuto mucosale contiene diverse cellule del sistema immunitario tra cui cellule presentanti l'antigene (APC) come le cellule dendritiche (DC) che sono coinvolte nell’induzione e fine regolazione delle immunità antivirale. Ciononostante, l'HIV trova il modo per superare questa prima linea di difesa immunitaria e propagarsi. A livello mucosale, gli eventi principali delle interazioni cellula-virus sono molteplici, coinvolgendo una serie di molecole capaci di legarsi al virus e / o a cellule della mucosa. Dal sito mucosale, le cellule APC e linfociti reclutati in situ migrano attraverso i dotti linfatici afferenti verso i linfonodi dove raggiungono l’area delle cellule T. Da qui le cellule T, ma non le DC, migrano attraverso le vie linfatiche efferenti e diffondono il virus a livello sistemico.
In questo contesto, la nostra attenzione è focalizzata su: 1) il tratto genitale maschile, 2) i microbicidi naturali presenti nel fluido seminale, 3) gli effetti di geni non strutturali Tat e Nef di HIV-1 sulla trasmissione mucosale e 4) sui meccanismi di infezione virale su cellule presenti nel sito di entrata.
1) Tratto genitale maschile. L’esposizione genitale/rettale allo sperma di individui infetti da HIV rappresenta il maggior rischio di contrarre l'infezione. Il tratto genitale ed il sangue sono compartimenti con distinte caratteristiche fisiche ed immunologiche entro i quali l'HIV risiede e muta a vari livelli. Durante il trattamento, nonostante il virus non sia rilevabile a livello sistemico (plasma), il DNA virale, sia come provirus che in forma episomale, potrebbe persistere per un significativo periodo di tempo rendendo il soggetto un potenziale trasmettitore. Di rilevanza è inoltre il fatto che il DNA virale è presente negli spermatozoi di pazienti sieropositivi. Nei pazienti cronicamente infettati esiste una popolazione virale eterogenea costituita da virus R5 e X4, mentre in pazienti con infezione acuta, sono prevalentemente presenti ceppi virali con tropismo R5. Una serie di studi ha suggerito che solo un limitato numero di ceppi virali è trasmesso per via mucosale al nuovo ospite. Tuttavia, il potenziale di replicazione di queste varianti non è stato ancora pienamente compreso. Pertanto, la nostra attenzione è focalizzata sulla i) valutazione della carica virale (plasma e cellule) e lo stato del genoma virale nel tratto genitale maschile, ii) caratterizzazione biologica e molecolare dei virus isolati da questo comparto, e iii) la trasmissione ad un nuovo ospite (macaco) mediante esposizione vaginale o rettale a particolari ceppi virali.
2) Microbicidi naturali presenti nel liquido seminale. Il liquido seminale contiene molecole che agiscono in diverse fasi e con modalità diverse e possono svolgere un ruolo rilevante nell’infezione primaria (mucosa vaginale o rettale). Infatti, fattori solubili possono i) influenzare l'apoptosi, ii) indurre l’opsonizzazione complemento-dipendente del virus HIV, l’attivazione delle cellule T, la produzione di linfochine regolatorie e pro-infiammatorie e proteine dello shock termico (heat-shock proteins), iii) inibire il legame di gp120 a DC-SIGN sulla DC. Pertanto, l'identificazione e la caratterizzazione di nuovi fattori solubili con rilevanti attività biologiche (attività immunomodulanti o effetti sull’infettività virale) è uno dei nostri obiettivi.
3) Effetti di geni non strutturali Tat e Nef di HIV-1 sulla trasmissione mucosale. Le proteine Tat e Nef di HIV-1, oltre ad avere un ruolo chiave nel ciclo di vita del virus, esercitano diversi effetti biologici (infiammazione, immunoattivazione) (Titti F. et al., Expert Opin. Emerg. Drugs 2007; Caputo A et al., Int. Rev. Immunol. 2009) che facilitano l’infezione e la disseminazione del virus. Di conseguenza, gli obiettivi del progetto sono: i) valutare il ruolo di Tat o di Nef nella modulazione del tropismo cellulare e dell’infettività alla porta di entrata del virus; ii) valutare il ruolo di HIV-1 Tat e Nef nel disregolazione del sistema immune; iii) studiare la trasmissione virale in vitro nei modelli mucosali; iv) studiare le fasi precoci dell’infezione e gli eventi patogenetici nel modello del primate non umano dopo esposizione mucosale a SHIV esprimente proteine HIV-1 Tat e Nef; v) studiare la comparsa e quindi l’evoluzione di varianti virali. La conoscenza dei meccanismi patogenetici della trasmissione dell’infezione, il ruolo esercitato da geni regolatori di HIV (Tat e Nef) saranno di fondamentale importanza per il disegno di interventi preventivi o terapeutici contro HIV/AIDS. Inoltre un valido contributo alla definizione di un vaccino efficace contro HIV/AIDS sarà dato dallo studio di varianti virali altamente suscettibili alla neutralizzazione. Il risultato di questi studi ed il fatto che si utilizzi il modello del primate non umano filogeneticamente vicino all’uomo, assicurano la piena e veloce trasferibilità di applicazione in trial clinici.
4) Meccanismi di infezione virale su cellule presenti nel sito di entrata. A questo proposito, sono attualmente i corso studi in vitro i) sul meccanismo(i) coinvolti nella regolazione della replicazione di isolati primari di HIV-1 a differente tropismo (CCR5-, CXCR-4- o dual-tropici CCR5/CXCR-4 su DC, macrofagi e cellule T CD4+ e ii) sull’analisi del tropismo e del fenotipo di virus primari geneticamente differenti isolati nelle diverse fasi dell’infezione. Di rilevanza, questi studi sono eseguiti utilizzando isolati virali da pazienti provenienti da diverse aree geografiche. I risultati saranno potenzialmente utilizzati in studi di struttura-funzione di envelope virali di diversa provenienza geografica ed allo scopo di sviluppare nuovi antigeni vaccinali contro l'HIV-1.

Sviluppo nel modello preclinico di sistemi di veicolazione mucosale di antigeni vaccinali.
I risultati di trial preclinici ottenuti nell’ambito di progetti Europei AVIP e MUVAPRED, hanno indicato che scimmie immunizzate con Tat e ΔV2 Env (gp140 di Env a cui è stata deleta la regione variabile denominata V2) in combinazione e sommininistrati sia per via sistemica che mucosale hanno indotto una immunità protettiva dopo challenge mucosale con virus chimerico SIV/HIV SHIVSF162P4AH595 CCR5-tropico cresciuto e titolato in scimmia. In particolare, abbiamo dimostrato la presenza di anticorpi cross-neutralizzanti indotti ad alti titoli ed in tempi più precoci quando i due antigeni sono stati somministrati contemporaneamente. Di rilevanza è l’osservazione che la somministrazione per via intranasale dei due antigeni combinati ha contenuto la disseminazione del virus dalla mucosa rettale ai linfonodi. Nel loro insieme, questi dati indicano che Tat, per la sua immunogenicità e le sue proprietà immuno-modulatorie, e ΔV2 Env, per la capacità di indurre anticorpi neutralizzanti ad ampio spettro, rappresentino antigeni modello necessari per il raggiungimento di una potenziale protezione neutralizzante contro HIV/AIDS.
Le mucose rappresentano la via più comune di trasmissione dell’infezione. Gli eventi precoci nelle interazioni virus-cellula ospite alla porta di infezione sono critici per la propagazione dell’infezione, per le modificazioni del tropismo virale, per l’evasione dalle risposte immuni locali. Quindi, lo sviluppo di sistemi di veicolazione (delivery), che inducano risposte immuni a livello delle mucosa e che al tempo stesso non presentino effetti tossici collaterali, rappresenta ad oggi, un aspetto fondamentale nel disegno di un vaccino sia preventivo che terapeutico contro HIV/AIDS. VEE/SIN (vettori chimerici contenenti genomi non completi del virus dell’encefalite equina venezuelana e Sindbis virus) esprimenti Tat e ΔV2 Env. I vettori VEE/SIN rappresentano un sistema ideale per la veicolazione di antigeni vaccinali in quanto non presentano tossicità, non inducono significative risposte antivettore, inducono potenti risposte immuni B e T. Riteniamo che la somministrazione per via mucosale di Tat e ΔV2 Env veicolati da vettori VEE/SIN rappresenti un sistema più efficiente rispetto ad altri vettori virali nell’induzione di una immunità mucosale protettiva contro HIV.
A questo proposito, le nostre attività sono volte a i) valutare in vitro gli effetti (risposta al vettore, agli antigeni, possibile riattivazione del virus) di VEE/SIN non ricombinanti od esprimenti Tat e ΔV2 Env, su cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di scimmie precedentemente esposte a SHIV ma aviremiche; ii) valutare la immunogenicità ed efficacia di VEE/SIN non ricombinanti od esprimenti Tat e ΔV2 Env in scimmie precedentemente esposte a SHIV ma aviremiche.
Questi studi ci forniranno importanti informazioni riguardanti l’ottimizzazione di strategie di veicolazione di antigeni vaccinali capaci di indurre risposte protettive a livello mucosale in modo da bloccare l’infezione. L’utilizzo di primati non umani filogeneticamente vicini all’uomo, fa sì che sulla base dei risultati, le metodologie utilizzate assicurano la piena e veloce trasferibilità di applicazione in trial clinici.

Patogenesi dell’infezione con virus chimerici SHIV e caratterizzazione molecolare di varianti virali nel modello preclinico del primate non umano
Attualmente non esistono ceppi di HIV-1 che replicano in modelli animali di primati. Per questo sono utilizzati chimere virali SIV/HIV (SHIV) che hanno il limite di contenere solo alcuni dei geni di HIV. Il nostro lavoro tende a sviluppare virus chimerici la cui composizione genica e patogenicità si avvicini a quella di HIV-1 nell’uomo. A questo proposito, avvalendosi di una collaborazione internazionale abbiamo ottenuto SHIV esprimente Nef di HIV di cui stiamo valutando la capacità replicativa e patogenicità in studi in vitro ed in vivo. La disponibilità di virus chimerici che contengano il più ampio spettro possibile di geni di HIV-1 permette di valutare nel modello preclinico, l’efficacia di approcci vaccinali contenenti proteine di HIV. Inoltre, a prosecuzione di studi già fatti nell’ambito di studi vaccinali in primati non umani basati sulle proteine Tat ed Env (Ridolfi B et al., Virus Genes 2008; Borsetti A et al., Arch. Virol. 2008), abbiamo pianificato uno studio sulla potenziale variabilità dei geni tat ed env durante le diverse fasi dell’infezione dopo esposizione mucosale al virus SHIV-SF162P4CY. Lo studio prevede i) la caratterizzazione molecolare delle varianti virali del virus SHIV-SF162P4CY; ii) il clonaggio ed espressione dei mutanti del virus SHIV-SF162P4CY; iii) l’identificazione dei determinanti genetici di patogenicità delle varianti del virus SHIV-SF162P4CY. Nell’ambito degli studi di patogenesi, avendo a disposizioni campioni di scimmie (vaccinate/protette, vaccinate/non protette e non vaccinate/infette), un aspetto rilevante che intendiamo studiare è lo stato del genoma virale (integrato, non integrato) a livello sistemico e mucosale, utilizzando il modello preclinico del primate non umano (Bona R. et al, Virus Res. 2007; Cara A et al., Virology, 2004).
Tali studi possono fornire nuove informazioni per la produzione di ceppi virali “molecolarmente definiti” ed utilizzabili in studi di trasmissione, patogenetici e vaccinali.

Modello del primate non umano: piattaforma preclinica per valutare i correlati umorali della protezione e per generare anticorpi antivirali per approcci terapeutici.
Come per molte altre malattie infettive, gli anticorpi neutralizzanti HIV-1 (NAbs) sono componenti essenziali di un'immunità protettiva. La somministrazione passiva dopo l'esposizione al virus, di anticorpi con potente attività neutralizzante isolati da rari casi di pazienti esposti all’infezione ma senza sintomatologie clinica, si è dimostrata protettive nel modello preclinico (Ferrantelli F et al., Virol. 2004). D’altra parte, è noto che durante i protocolli di vaccinazione o nell'infezione naturale, anche se NAbs sono prodotti, il virus continua a replicare. Questo suggerisce che da soli i NAbs potrebbero non essere sufficienti a bloccare il virus dopo una esposizione mucosale o ad eradicare il virus dai santuari virali. Inoltre, lo sviluppo di un immunogeno Env con un'attività neutralizzante potente ed ad ampio spettro rimane ancora oggi un obiettivo non raggiunto.
Le nuove conoscenze sulla patogenesi di HIV-1 indicano che le proteine non strutturali Nef e Tat di HIV-1 esercitano un ruolo chiave nel ciclo virale ed esercitano molteplici effetti sulle cellule dell’ospite favorenti l'infezione e la diffusione del virus. In pazienti infettati con HIV-1, anticorpi (Abs) contro HIV-1 Tat e Nef sono stati associati ad un controllo dell’infezione e quindi al blocco o rallentamento della progressione clinica (Rezza G et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents 1992; Rezza G et al., J. Infect. Dis. 2005). Così gli anticorpi contro Tat e Nef, eliminando le cellule infette e/o inibendo le attività biologiche indotte da Tat e Nef, rappresentano elementi chiave da considerare negli approcci vaccinali preventivi e/o terapeutici.
Lo studio sulle funzioni effettrici antivirali di cellule immuni (NK, monociti/macrofagi, granulociti) associate con il frammento Fc di Ab, è un campo emergente ma finora non completamente esplorato nella valutazione delle componenti umorali correlanti con uno stato protettivo. Recenti risultati di studi preclinici indicano che la citotossicità cellulare dipendente dall'anticorpo (ADCC) e l'inibizione mediata dall’anticorpo della trasmissione virale cellula-cellula (ADCVI) possono rappresentare importanti risposte associate allo stato protettivo. D’altro canto è stato anche descritto che l’interazione di immunocomplessi virus-specifici con Fc e/o i recettori del complemento, può paradossalmente aumentare l'entrata e la replicazione virale in cellule T, monociti/macrofagi e granulociti. La conoscenza dell’equilibrio tra funzioni effettrici anti-virali e pro-virali assume una notevole importanza sia per individuare i correlati di protezione che per generare nuovi efficaci antigeni vaccinali e per sviluppare gli interventi immunoterapeutici. Pertanto i nostri obiettivi sono: i) identificare nel modello del primate non umano le classi e sottoclassi delle immunoglobuline (IgM, IgG, IgA) antigene-specifici (proteine strutturali e non strutturali di SIV e di HIV) potenzialmente collegati con la osservata protezione; ii) generare in vitro anticorpi contro proteine strutturali e non strutturali di HIV-1 da usare per a) identificazione di nuovi epitopi antivirali con conseguente generazione di nuovi antigeni vaccinali e b) sviluppo di approcci terapeutici. L’identificazione di risposte umorali correlate con la protezione, oltre alla conoscenza di nuove attività antivirali degli anticorpi contro proteine regolatorie e strutturali, permetterà di disegnare nuovi antigeni vaccinali. Al tempo stesso, la creazione di anticorpi ricombinanti contro proteine strutturali e regolatorie di HIV, se risultati non tossici ed efficaci nel modello preclinico, rappresenta uno step essenziale per approntare protocolli di interventi nell’uomo dopo opportune modifiche (umanizzazione) al fine di evitare effetti tossici gravi se inoculati nell’uomo.

Pubblicato il 10-10-2010 in Attività di ricerca , aggiornato al 28-03-2014

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