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   Responsabile:  Barbara Ensoli
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Attività di ricerca

Attività di ricerca del Reparto "Patogenesi dei Retrovirus"

Direttore: Dr. Maurizio Federico

Studio degli inibitori di proteasi anti-HIV come nuovi microbicidi contro la trasmissione di HIV
I microbicidi anti-HIV aiutano nella riduzione della trasmissione dell’infezione. Purtroppo, i composti finora testati in clinica sono risultati inefficaci o solo parzialmente efficaci nell'impedire la trasmissione del virus. Quindi, trovare nuove strade atte ad impedire la trasmissione del HIV è ancora una priorità urgente. Per quanto riguarda il meccanismo di trasmissione dell’HIV, sono state proposte diverse ipotesi. Fra queste, la cattura dei virioni da parte delle cellule dendritiche (DC) che vengono in contatto con le cellule infettate nel sito di trasmissione (comunemente mucose ano-genitali) è considerato un processo critico nell'infezione primaria da HIV. Quindi, trovare nuove vie per inibire l'internalizzazione dell’HIV in DC deve essere considerato di importanza estrema per nuove strategie profilattiche anti-HIV. In questo senso, abbiamo dimostrato recentemente che il trattamento con inibitori di proteasi (PI) dell’HIV di DC in co-coltura con cellule infettate con HIV-1 (linfociti T CD4+, macrofagi) impedisce la trasmissione DC-mediata di HIV-1 ai linfociti vicini (trans-infezione) (Muratori C. et al., J. Gen. Virol. 2009). Questo evento è associato ad una drastica riduzione dell’endocitosi di HIV-1 come conseguenza probabile di livelli ridotti di adesione cellula-cellula così come di alterazioni nella matrice extracellulare. I nostri dati sperimentali suggeriscono come l'effetto inibitorio sulla trans-infezione sia completamente indipendente dall'effetto antivirale dei PI. Piuttosto, sembra la conseguenza degli effetti dei PI sulle funzioni cellulari coinvolte nel contatto cellula-cellula e nel processo di endocitosi, così come dell'influenza indiretta dei PI sul profilo di espressione dei geni, sia delle DC che delle cellule infette. In questo senso, stiamo provando a chiarire gli eventi molecolari che generano gli effetti osservati con i PI. A riguardo, abbiamo già osservato che i PI riducono l’adesività delle DC alle cellule infettate con HIV-1 attraverso l'inibizione di espressione di ICAM-1 sulla membrana delle DC (Muratori C. et al., J. Gen. Virol. 2009). D’altra parte abbiamo anche notato che i PIs inibiscono l'espressione della metalloproteasi (MMP)-9 sia in DC che in cellule infettate da HIV-1 (Muratori C. et al., J. Virol. 2007). Inoltre, il trattamento con inibitori di MMP-9 di DC coltivate con cellule infettate da HIV-1 inibisce la trans-infezione. Quindi, supponiamo che fenomeni di riorganizzazione della matrice extracellulare partecipino al meccanismo del passaggio cellula-cellula di HIV. Questa osservazione merita un approfondimento poiché potrebbe contribuire a chiarire i meccanismi che sono alla base dell'inibizione della trans-infezione indotta dai PI.

Patogenesi dell’encefalite indotta da HIV: analisi delle conseguenze del contatto di cellule infette da HIV-1 con astrociti
Prima dell’introduzione della HAART, l'incidenza della demenza HIV-collegata (HAD) era del 7%. Dopo l'introduzione della HAART, l'incidenza di HAD è diminuita significativamente ma, a partire dal 2003, è di nuovo aumentata con il prolungamento della sopravvivenza dei pazienti con AIDS. Attualmente l’HAD rappresenta, nelle sue varie forme, un problema rilevante sia per i pazienti non trattati (long term survivors) che per i pazienti trattati con HAART. Buona parte dei meccanismi che sono alla base dell'encefalite collegata all’infezione da HIV restano da chiarire, anche se ricerche approfondite sono in corso nei laboratori di tutto il mondo. L'infiltrazione di cellule infettate da HIV-1 attraverso la barriera emato-encefalica (BEE), in particolare monocito-macrofagi che sono reservoirs per l’HIV nei pazienti trattati con HAART, può portare al loro contatto con diversi tipi di cellule nervose, in particolare microglia, astrociti, neuroni, ed oligodendrociti. Pertanto, per una piena comprensione dei meccanismi dei processi neuroinfiammatori indotti da HIV, è importante analizzare gli effetti del contatto delle cellule nervose con le cellule infettate. Questo anche indipendentemente dai livelli di replicazione virale, che nel sistema nervoso centrale (SNC) sono elevati soltanto in cellule della microglia.
I macrofagi infiltrati e le cellule giganti multinucleate sono considerati, insieme alla morte dei neuroni, marcatori patogenetici specifici per l’HAD. In questo contesto, stiamo analizzando gli effetti del contatto fra macrofagi infetti da HIV-1 ed astrociti. Gli astrociti sono cellule stellate multifunzionali caratterizzate dalla capacità di liberare quantità elevate di fattori solubili e fondamentali per l’omeostasi del SNC. Essi infatti fungono da supporto per le cellule endoteliali della BEE, forniscono nutrienti al tessuto nervoso, mantengono il corretto equilibrio ionico extra-cellulare e sono coinvolti nei processi di riparazione che seguono le lesioni traumatiche. Attualmente, stiamo studiando gli effetti del contatto dei macrofagi infettati da HIV-1 con gli astrociti in termini di definizione delle variazioni trascrizionali negli astrociti, del rilascio di fattori solubili e della vitalità delle cellule. Infatti, considerando che la perdita di neuroni indotta da HIV è soltanto in minima parte conseguenza diretta della replicazione di HIV, è possibile che un’alterazione dei fattori solubili rilasciati svolga un ruolo importante nella morte dei neuroni. A questo proposito, è stato notato che l'espressione di HIV in macrofagi correla con un profilo alterato della secrezione di fattori solubili e di marcatori della membrana cellulare che possono essere coinvolti nell’avvio dei processi neuroinfiammatori. A questo riguardo, abbiamo recentemente descritto le conseguenze virologiche ed immunologiche del contatto cellula-cellula tra cellule HIV-1 infette e linfociti CD4+, macrofagi o cellule dendritiche (Muratori C. et al., J. Virol. 2007; Ruggiero E. et al., J. Virol. 2008; Muratori C. et al., J. Gen. Virol. 2009). Estendere queste osservazioni alle cellule del sistema nervoso è rilevante considerando che il processo di infiammazione neurale tipico della patologia AIDS è stato correlato all’ infiltrazione di cellule infettate da HIV-1, specialmente macrofagi che aderiscono all'endotelio dei vasi sanguigni, e trasmigrano nel cervello, diventando potenziali attivatori dei processi neuroinfiammatori. Lo studio dei meccanismi dell'encefalite indotta da HIV potrebbe portare all’identificazione di nuove molecole terapeutiche, utili per la prevenzione od il contenimento di una complicanza importante dell’infezione da HIV.

Sviluppo di una piattaforma biotecnologica innovatrice per vaccini capaci di indurre risposte T CD8+ citotossiche (CTL) contro malattie virali e tumorali
Malgrado progressi importanti nella diagnosi e nel trattamento, le malattie infettive ed il cancro rimangono le principali cause di morte. Quindi, lo sviluppo di vaccini per la cura delle infezioni e dei tumori rappresenta un obiettivo prioritario. La ricerca è riuscita a sviluppare vaccini profilattici per varie malattie infettive. Tuttavia, malgrado sforzi enormi, per molti agenti patogeni cronici prevalenti quali il virus dell’epatite C (HCV), la maggior parte di virus erpetici, il virus dell’immunodeficienza umana (HIV), la tubercolosi da micobatterio ed il plasmodio della malaria, ancora mancano vaccini protettivi per l'uomo.
L’infezione virale può essere neutralizzata da anticorpi virus-specifici attraverso il cosiddetto fenomeno di “neutralizzazione”. Anche se questo può bloccare la replicazione virale, in molti casi può non essere sufficiente ed il controllo delle infezioni virali trarrebbe giovamento dall'induzione dei meccanismi immuni alternativi. In questo senso, i CTL possono essere cruciali per l'eliminazione delle infezioni virali alla luce della loro capacità di riconoscere ed uccidere le cellule infettate dal virus. Questo può essere vero per le malattie virali, per tumori virus-indotti ed anche per tumori virus-indipendenti, in cui l'induzione di CTL contro gli antigeni tumore-associati può essere importante per l’eliminazione delle cellule tumorali. In questo senso, un razionale importante per lo sviluppo dei vaccini contro il cancro proviene dall'osservazione che la fase di innesco della risposta immunitaria antitumorale in malati di cancro è difettosa o compromessa. Di conseguenza, l'induzione di CTL può almeno in parte colmare questa deficienza. Similmente, in molte malattie infettive la risposta CTL è troppo tardiva e insufficiente per un efficace controllo. Pertanto l’induzione di una potente risposta CTL rappresenta la sfida più importante per diverse strategie vaccinali. Negli ultimi decenni, sono state proposte varie strategie vaccinali per indurre risposte CTL efficaci. Fra queste l’utilizzo di virus attenuati, vettori virali recombinanti e vaccini a DNA. Tuttavia, problemi di sicurezza e di efficacia hanno ostacolato finora il loro uso in clinica.
Le Virus-like particles (VLP) sono particelle virali auto-assemblanti, inerti, non patogene e prive di genoma. Le VLP mantengono la struttura di un virus e possono essere costruite per incorporare vari antigeni e, almeno nel caso d VLP retro- e lentivirali, di proteine dell’involucro virale. Le VLP sono efficaci nell’indurre risposte sia di CTL che di cellule T CD4+, oltre ad essere ottimi induttori di immunità umorale. Allo stato attuale, i vaccini anti-HPV approvati per l’uso nell’uomo sono basati su preparazioni di VLP. Quindi, le VLP possono rappresentare una piattaforma vaccinale sicura ed efficace. Le VLP possono anche essere impiegate come elementi portanti antigeni eterologhi. Purtroppo, nella maggior parte dei casi l'incorporazione dell'antigene nelle proteine strutturali delle VLP ha prodotto problemi in termini di assemblaggio della particella virale. Per superare questo problema abbiamo utilizzato un mutante della proteina Nef di HIV-1 dotato di proprietà particolari. Nef di HIV-1 è una proteina miristilata di 27 kDa che si incorpora nei virioni a bassi livelli, intorno 10 molecole per particella virale. Il nostro laboratorio ha recentemente caratterizzato un mutante di Nef (Nef7) che si localizza preferenzialmente in speciali strutture organizzate della membrana cellulare denominate lipid rafts, e questa caratteristica correla con un'alta efficienza di incorporazione nel virione (circa 100 volte più della proteina non mutata, wild-type) (Peretti S. et al., Mol. Ther. 2005; Peretti S. et al., Virology 2006). Nef7 può fungere da molecola di trasporto a seguito di fusione al C-terminale con proteine eterologhe molto grandi, almeno fino a 630 aminoacidi, come nel caso della proteina di HCV NS3. Abbiamo sviluppato una tecnologia basata su VLPs di origine retro- e lentivirale dove Nef7 può essere fuso con gli antigeni eterologhi. La pseudotipizzazione di queste VLP con la proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), come pure con proteine alternative (per esempio, quelle del virus della rabbia o del virus RD114) migliora l'efficienza di presentazione dell’antigene, nel contempo favorendo la risposta CD8 specifica attraverso il meccanismo della cross-presentazione. A questo proposito, è ben noto che le DC hanno la capacità di processare antigeni extracellulari e di presentarli in associazione con le molecole di classe I del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I). Questa via esogena alternativa, nota come cross-presentazione, svolge un ruolo importante nella generazione di risposte immuni CTL. In questo senso, le VLP aventi VSV-G o proteine dell’involucro di caratteristiche simili che vengono catturate dalle DC tramite endocitosi vanno incontro a fusione nel comparto endosomiale, con rilascio del proprio contenuto nel citoplasma. Questo processo può favorire la presentazione in associazione con molecole MHC-I attraverso l’interazione con il proteasoma e conseguente degradazione dell’antigene in epitopi che si associano alle molecole MHC-I. Inoltre, abbiamo osservato che l'internalizzazione delle molecole associate alle nostre VLP induce una forte attivazione/maturazione delle DC. Questa proprietà rappresenta un valore aggiunto supplementare per le strategie vaccinali basate sulle nostreVLP.
La varietà di antigeni che stiamo valutando nel contesto del sistema di Nef7 VLP sarà sufficiente per fornire una valutazione definitiva sulla relativa efficacia delle nostre VLP come piattaforma vaccinale. Per la prima serie di esperimenti abbiamo selezionato antigeni di patogeni presumibilmente più sensibili alla risposta CTL. In dettaglio, abbiamo già prodotto caratterizzato VLP che trasportano proteine di HPV, HCV, Influenza, nonché antigeni tumorali da melanomi umani. La piattaforma biotecnologica per la preparazione di vaccini innovativi volti ad indurre risposte CTL e qui descritta può considerarsi di grande interesse per lo sviluppo di nuove terapie immunologiche. I metodi alla base della preparazione delle VLP sono ormai ben stabiliti, e le industrie biotecnologiche potranno sfruttare la grande quantità di dati di letteratura correlati alla soluzione dei problemi inerenti alla preparazione delle VLP in GMP. Quindi, qualora le nostre ricerche abbiano esiti incoraggianti, non si vedono ostacoli importanti per il passaggio in clinica della piattaforma vaccinale basata sulle VLP Nef7 per l’induzione di risposte cellulari citotossiche (CTL) contro gli antigeni prescelti.

Pubblicato il 08-11-2010 in Attività di ricerca , aggiornato al 28-03-2014

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